Western Blot Fehlerbehebung

Lösen Sie Ihre Western-Blot-Probleme mit diesen Tipps zur Fehlerbehebung, die häufige Ursachen für kein Signal, hohen Hintergrund, mehrere Bänder und mehr abdecken.

1. Kein Signal
2. Hoher Hintergrund.
3. Mehrere Bands.
4. Ungleichmäßige weiße "Flecken" auf dem Fleck.
5. Schwarze Punkte auf dem Fleck.
6. Weiße Bänder auf einem schwarzen Fleck.
7. Die Molekulargewichtsmarkierungsspur ist schwarz.

1. Warum funktioniert mein Western Blot nicht??
2. Warum ist mein Western Blot verschmiert??
3. Waschen Sie sich nach dem Blockieren des Western Blot??
4. Was verursacht unspezifische Bindung im Western Blot?
5. Wie kann ich meine Western-Blot-Ergebnisse verbessern??
6. Warum verwenden wir Milch im Western Blot??
7. Was sind die Schritte des Western Blots??
8. Können Sie einen Western Blot übertragen??
9. Wie bestätigen Sie die Übertragung von Proteinbanden vom Gel auf die Membran im Western Blot-Protokoll??
10. Wie lange können Sie einen Western Blot blockieren??
11. Können Sie einen Western Blot über das Wochenende blockieren??
12. Wie oft können Sie einen Western Blot entfernen?

Warum funktioniert mein Western Blot nicht??

Wenn Sie zu wenig Protein haben, wenn Ihr Primärantikörper keine hohe Affinität aufweist oder wenn Ihr Primärantikörper eine nicht optimale Verdünnung aufweist, wird Ihr Protein nicht angezeigt. Wenn Sie zu viel Protein laden, kann das Signal-Rausch-Verhältnis alternativ steigen, was zu Schwierigkeiten bei der Visualisierung führt.

Warum ist mein Western Blot verschmiert??

Was ist der Grund für einen Abstrich in einem Western Blot? Wie Sie an der Ponceau-Färbung des Transfers sehen können, verläuft ein Abstrich durch die ersten 7 Spuren. Die Proben sind embryonale Stammzellen, die durch 2 × LSB-Probenpuffer, Pipettieren und Kochen lysiert wurden. ... Anscheinend ist der Abstrich auf zu viele Zellen in einem Brunnen zurückzuführen.

Waschen Sie sich nach dem Blockieren des Western Blot??

Das Blockieren ist ein sehr wichtiger Schritt in der Immundetektionsphase des Western Blot, da es die unspezifische Bindung des Antikörpers an die Blotmembran verhindert. Nach dem Blockieren wird der Blot in Waschpuffer, üblicherweise TBST, unter leichtem Rühren und in ausreichendem Volumen gespült, um den Blot unter Wasser zu halten. ...

Was verursacht unspezifische Bindung im Western Blot?

Eine der häufigsten Ursachen für unspezifische Banden ist die unvollständige Blockierung. Blockierungspuffer werden verwendet, um zu verhindern, dass primäre und sekundäre Antikörper an die Membran oder etwas anderes als das interessierende Protein binden.

Wie kann ich meine Western-Blot-Ergebnisse verbessern??

Lösung

1. Reduzieren Sie die Primärantikörperkonzentration.
2. Verringern Sie die Menge des auf das Gel geladenen Gesamtproteins.
3. Passen Sie die Membranblockierungsbedingungen an.
4. Erhöhen Sie die Anzahl der Wäschen.
5. Überprüfen Sie die Spezifität des Antikörpers.
6. Blot mit dem sekundären Antikörper allein.
7. Wenn sich Banden entwickeln, wählen Sie einen alternativen sekundären Antikörper.

Warum verwenden wir Milch im Western Blot??

Das Blockieren ist ein sehr wichtiger Schritt beim Western Blot, da es verhindert, dass Antikörper unspezifisch an die Membran binden. Das Blockieren erfolgt häufig mit 5% BSA oder fettfreier Trockenmilch, die in TBST verdünnt ist, um den Hintergrund zu verringern. ... Der Antikörper kann in einem Waschpuffer wie PBS oder TBST verdünnt werden.

Was sind die Schritte des Western Blots??

Das Western-Blot-Verfahren und der Nachweisassay umfassen fünf Schritte, nämlich Transfer, Blockierung, Inkubation des Primärantikörpers, Inkubation des Sekundärantikörpers und Proteinnachweis sowie Western-Blot-Analyse.

Können Sie einen Western Blot übertragen??

Mit zunehmender Zeit besteht jedoch die Gefahr einer Überübertragung (Abstreifen, Durchblasen) der Proteine ​​durch die Membran, insbesondere bei niedrigerem Molekulargewicht (<30 kDa) Proteine ​​bei Verwendung von Membranen mit einer größeren Porengröße (0,45 um). Arbeitsablauf des Nass- / Tank-Elektrotransfers von Protein für das Western Blot.

Wie bestätigen Sie die Übertragung von Proteinbanden vom Gel auf die Membran im Western Blot-Protokoll??

Proteintransferprotokoll

1. Bereiten Sie die PVDF-Membran vor, indem Sie sie 30 Sekunden lang in Methanol benetzen und dann kurz in destilliertem Wasser einweichen, gefolgt von 1 × Transferpuffer. ...
2. Filterpapiere und Schwämme vor dem Zusammenbau des Transfersandwichs 10 Minuten im Transferpuffer einweichen.

Wie lange können Sie einen Western Blot blockieren??

Im Allgemeinen sollte die maximale Blockierungszeit 2 Stunden bei Raumtemperatur nicht überschreiten, da sonst Proteine ​​von der Membran ausgetauscht werden können. Verdünnen Sie den primären Antikörper auf die empfohlene Konzentration / Verdünnung in frischer Blockierungslösung (TBS und / oder PBS (PBS Tablets 524650-1EA) / 3% fettfreie Trockenmilch)..

Können Sie einen Western Blot über das Wochenende blockieren??

Starke Titer-Antikörper funktionieren am besten bei einer kurzen Inkubation und schwache Reifenantikörper erfordern eine längere Inkubation (bei höherer Konzentration). Es tut nicht weh, den Blot über Nacht oder über das Wochenende bei 4 ° C im Blockierungspuffer zu belassen.

Wie oft können Sie einen Western Blot entfernen?

Auch wenn wir versuchen, die primären Antikörper zu entfernen, ist zu beachten, dass es wahrscheinlich ist, dass Sie einen Teil des Proteins verlieren können, das Sie an die Membran gebunden oder übertragen haben. Daher ist es ratsam, die Membran nicht mehr als einmal zu entfernen.